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    • 专利摘要:
    Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine isotonische Gefrierschutzlösung zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen, auf Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen durch Gefrierkonservierung, Vitrifikation oder durch Mikroinjektion, auf Verfahren zum Auftauen von eingefrorenen Fischeiern und/oder Fischembryonen, auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Gefrierschutzlösung sowie auf eine Kühlbox zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen.
    公开号:DE102004030285A1
    申请号:DE200410030285
    申请日:2004-06-23
    公开日:2006-01-12
    发明作者:Franz Lahnsteiner；Alois Glienke
    申请人:Alois Glienke；Franz Lahnsteiner；
    IPC主号:A01K61-00
    专利说明:
    [0001] Diekommerzielle Aufzucht von Fischen wird heutzutage im wesentlichenin Fischfarmen mit Hilfe der künstlichenBesamung von Fischeiern durchgeführt.Da jedoch die Qualitätwie auch die Menge von Samen und Eiern von Fischen in solchen Zuchtbetriebenaufgrund äußerer Einflüsse starkschwankt und sich auch im Verlauf der Laichzeit und mit dem Alterder Fische verändert(Billard et al. 1971, Stoss 1983, Büyükhatipoglu & Holtz 1984), ist eine Sicherstellungeiner gleichbleibenden Samenqualität wie auch die gleichmäßige Verfügbarkeitvon Samen, Fischeiern und Fischembryonen zu jedem Zeitpunkt einesProduktionszyklus von äußerstemwirtschaftlichen Interesse.
    [0002] Nebendem rein wirtschaftlichen Interesse bei der kommerziellen Aufzuchtvon Fischen besteht auch ein besonderes Interesse bei der Erhaltunganderer, nicht kommerziell genutzter Fischarten. Viele Fischarten zählen heutebereits zu gefährdetenTierarten und sind in den „RotenListen gefährdeterTierarten" zu finden. Invielen Ländernwerden heute bereits zahlreiche Schutzmaßnahmen durchgeführt, wieRevitalisierung der Gewässer,Schutz der natürlichenRessourcen und Habitatmanagement mit möglichst geringem antropogenemEinfluß.Diese Maßnahmensind jedoch längerfristig.Stark gefährdeteArten und stark gefährdeteautochthone Rassen könnenallerdings ausgestorben sein, bevor diese Maßnahmen greifen, da in solchenPopulationen die Individuenzahl zu gering ist, um die natürliche Reproduktionin ausreichender genetischer Variabilität zu gewährleisten (Gilpin und Soule1986). Daher ist auch hier die Anlage von Depots von Embryonen oderEiern und Samen zur Konservierung von genetischem Material in genügend hoherVariabilitätvon hohem Interesse, um bei künstlichenNachzucht- und Wiederbesatzmaßnahmenstabile Populationen zu erzielen. Ein Verfahren zur Konservierungvon Embryonen oder Eiern besitzt daher eine besondere Bedeutungin der Erhaltung der Biodiversität.
    [0003] Inbisherigen Verfahren werden Samen und Rogen aus Fischen aufgrundihrer mangelnden Haltbarkeit bei physiologischen Bedingungen jedoch üblicherweisedirekt nach ihrer Gewinnung verarbeitet. Versuche zur Konservierungvon Samen und Rogen von Fischen sind im Stand der Technik zwar bekannt,führtenjedoch lediglich im Rahmen der Konservierung von Fischsamen zu Erfolgen.
    [0004] Versuchezur Konservierung von Fischeiern und Fischembryonen dagegen, insbesondereder Gefrierkonservierung von Fischeiern und Embryonen, sind jedochkaum bekannt und mit Ausnahme von sehr grundlegenden Untersuchungensind auf diesem Gebiet kaum Erfolge vorzuweisen. Die bisher veröffentlichten grundlegendenStudien untersuchen im wesentlichen die Permeabilität von Fischeiernsowie die Diffusion von Gefrierschutzsubstanzen in diese Systeme(z.B. Hagedorn, M., E. Hsu, F. W. Kleinhans, and D. E. Wildt 1997. Newapproaches for studying the permeability of fish embryos: Towardsuccessful cryopreservation. Cryobiology. 34: 335-347; und Hagedorn,M., S.L. Lance, D. M. Fonseca, F.W. Kleinhans, D. Artimov, R. Fleischer, A.T.M.S.Hoque, and B.S. Pukanzhenthi 2002. "Altering the membranes of fish embryoswith aquaporin-3: an essential step for cryopreservation", Biology of Reproduction67:961-966).
    [0005] ImWesentlichen sind heutzutage zwei Varianten der Konservierung vonlebenden biologischen Proben bekannt: die klassische Gefrierkonservierungund die Vitrifikation.
    [0006] Dieklassische Gefrierkonservierung stellt ein Verfahren zum langsamenund kontrollierten Einfrieren von biologischen Proben dar. Dabeiwird die Probe zumeist einem Dampf aus Flüssigstickstoff ausgesetzt und sehrlangsamen Abkühlungsratenunterworten.
    [0007] Ansätze zurklassischen Gefrierkonservierung sind z.B. aus Hagedorn et al. (1998)und Hagedorn et al. (2002) bekannt. Beispielsweise beschreiben Hagedornet al. (2002) Versuche zur.
    [0008] EineAnwendung der klassischen Gefrierkonservierungsverfahren für die Konservierungvon Fischeiern und/oder Fischembryonen war bislang jedoch nichterfolgreich.
    [0009] EineAlternativtechnik zu der oben beschriebenen Gefrierkonservierungvon biologischen Proben stellt die bereits erwähnte sogenannte Vitrifikationdar. Bei der Vitrifikation werden den biologischen Proben zur Konservierunghohe Konzentrationen an Gefrierschutzsubstanzen zugegeben. Anschließend werdendie Proben direkt in Flüssigstickstoffeingebracht, wodurch sehr hohe Einfrierraten erzielt werden. Diesesrasche Einfrieren hat zur Folge, dass in den Proben keine Veränderungenund insbesondere keine Eiskristallbildungen stattfinden können.
    [0010] Vitrifikationsmethodensind bisher jedoch lediglich fürdie Oozyten und Embryonen von Säugernbekannt und werden dort erfolgreich angewendet.
    [0011] Eine Übertragungder fürOozyten und Embryonen von Säugerngefundenen Vitrifikationsbedingungen auf Fische war bislang jedochnicht erfolgreich, da die physiologischen Vorrausetzungen bei Oozytenund Embryonen von SäugerngegenüberFischen völligunterschiedlich sind. Das Einfrieren von Fischeiern und Fischembryonenmittels der Vitrifikation stellt daher ein bislang ungelöstes Problemdar und die Problematik wird nur in wenigen Publikationen behandelt.(siehe z.B. Tian, YS, Chen, S.L., Yan, A.S., Ji, X.S., and Yu, G.C. (2003).Cryopreservation of the sea perch (Lateolabrax japonicus) embryosby vitrification. Acta Zoologica Sinica 49: 843-850).
    [0012] Ausgehendvom Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung das technischeProblem zugrunde, ein Verfahren zur Konservierung von Eiern und/oderEmbryonen von Fischen, das die gleichmäßige Verfügbarkeit von Fischeiern und/oderFischembryonen zu jedem Zeitpunkt eines Produktionszyklus ermöglicht, anzugeben.Ein weiteres Problem bestand in der Herstellung geeigneter Reagenzienzur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen.
    [0013] Dasder vorliegenden Anmeldung zugrundeliegende technische Problem wirderfindungsgemäß gelöst durcheine isotonische Gefrierschutzlösungzur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen enthaltend: a) ein Alkalimetallsalz und/oder ein Erdalkalimetallsalz; b) eine interne Gefrierschutzsubstanz, die in der Lage ist,in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren; c) eine externe Gefrierschutzsubstanz, die nicht in der Lageist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren, und d) eine Puffersubstanz.
    [0014] Dievorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Konservierungvon Fischeiern und/oder Fischembryonen umfassend folgende Schritte: a) Inkubieren der Fischeier und/oder Fischembryonenin der erfindungsgemäßen Gefrierschutzlösung, so dasseine homogene Durchdringung der Fischeier und/oder Fischembryonenmit dieser Gefrierschutzlösungerreicht wird; b) Inkubieren der nach Schritt a) erhaltenen Fischeier und/oderFischembryonen in mindestens einer weiteren erfindungsgemäßen Gefrierschutzlösung, dieeine höhereKonzentration als die unter Schritt a) verwendete Gefrierschutzlösung besitzt;und c) Einfrieren der unter Schritt b) inkubierten Fischeier und/oderFischembryonen.
    [0015] Ebenfallsmit umfasst ist ein Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oderFischembryonen umfassend folgende Schritte: a)Mikroinjektion von Fischeiern und/oder Fischembryonen mit der erfindungsgemäßen Gefrierschutzlösung, sodass eine homogene Durchdringung der Fischeier und/oder Fischembryonenmit dieser Gefrierschutzlösungerreicht wird; und b) Einfrieren der unter Schritt a) mikroinjizierten Fischeierund/oder Fischembryonen.
    [0016] Eineweitere Ausführungsformder vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auftauen von Fischeiernund/oder Fischembryonen, die nach einem der oben genannten erfindungsgemäßen Verfahreneingefroren wurden, umfassend den Schritt des Erwärmens dereingefrorenen Fischeier und/oder Fischembryonen 10-30 sec auf 30-40°C.
    [0017] Ebenfallsmit umfasst von der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zumRevitalisieren von Fischeiern und/oder Fischembryonen, die nachdem vorhergenannten erfindungsgemäßen Verfahren aufgetaut wurden,umfassend das Einstellen der gewünschtenEndkonzentration an internen und externen Gefrierschutzsubstanzenin den Fischeiern und/oder Fischembryonen und Inkubieren der Fischeierund/oder Fischembryonen in einer isotonischen Lösung.
    [0018] Dievorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Gefrierschutzlösung zurKonservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen.
    [0019] Schließlich betrifftdie vorliegende Erfindung eine fürdas erfindungsgemäße Verfahrengeeignete Kühlboxzur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen bestehendaus einer Kammer 1 mit Deckel 2 und einer über demBoden angebrachten Überlaufvorrichtung 3,wobei die Kammer von einer Isolierung 4 und einer Außenschicht 5 umgebenist und sich in der Kammer eine in vertikaler Richtung verstellbareHebevorrichtung 6 befindet.
    [0020] Weiterebevorzugte Ausführungsformenwerden in der folgenden ausführlichenBeschreibung der vorliegenden Erfindung erläutert.
    [0021] 1.Vorrichtung zum Einbringen der Eier in die Verdünnerlösungen. 1 – äußeres Gefäß, 2 – inneres Gefäß mit durchbrochenemBoden aus Gitternetz, 3 – Handgriff, 4 – Fischeierund/oder Fischembryonen, 5 – isotonische Gefrierschutzlösung.
    [0022] 2.Vorrichtung zur Äquilibrierungvon Fischeiern und -embryonen unter erhöhtem Druck. 1 – Druckkammer, 2 – Gefäß mit Eiern, 3 – Deckelder Druckkammer, 4 – Kolbenmit Gewinde, 5 – Eierbzw. Embryonen, 6 – Manometer, 7 isotonischeGefrierschutzlösung.Der Druck wird durch manuelles Hineinschrauben des Kolbens erhöht.
    [0023] 3.Kühlboxzur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen bestehendaus einer Kammer 1 mit Deckel 2 und einer über demBoden angebrachten Überlaufvorrichtung 3 miteinem Überlaufventil;Die Kammer ist von einer Isolierung 4 und einer Außenschicht 5 umgeben;In der Kammer befindet sich eine in vertikaler Richtung verstellbareHebevorrichtung 6, die optional einen Rost 7 zumAuflegen von Gefriergut besitzt und optional eine Fixierschraube 8 undeine Halterung fürden Rost 9; Wie bereits oben erwähnt wird das der vorliegendenErfindung zugrundeliegende technische Problem erfindungsgemäß durcheine isotonische Gefrierschutzlösungzur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen sowie durchVerfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonengelöst. DasVerfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonenumfasst bevorzugt folgende Arbeitsschritte: Inkubieren der Fischeierund/oder Fischembryonen in einer isotonischen Gefrierschutzlösung, umeine Durchdringung mit Gefrierschutz zu erreichen, Einfrieren derFischeier und/oder Fischembryonen, sowie optional Lagerung in Flüssigstickstoff,Auftauen und/oder Revitalisierung der eingefrorenen Fischeier und/oderFischembryonen.
    [0024] ImFolgenden sollen die einzelnen Stadien des erfindungsgemäßen Verfahrenssowie der erfindungsgemäßen Gefrierschutzlösung unddie bevorzugten Ausführungsformennäher erläutert werden.
    [0025] DieGrundlage fürdas Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dererfindungsgemäßen isotonischenGefrierschutzlösungzur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen. Dieseisotonische Gefrierschutzlösungenthältein Alkalimetallsalz und/oder ein Erdalkalimetallsalz, eine interneGefrierschutzsubstanz, die in der Lage ist, in die Fischeier und/oderFischembryonen zu diffundieren, eine externe Gefrierschutzsubstanz,die nicht in der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonenzu diffundieren, und eine Puffersubstanz.
    [0026] Gemäß einerAusführungsformder vorliegenden Erfindung wird das Alkalimetallsalz aus Natrium-und Kaliumsalzen und das Erdalkalimetallsalz aus Magnesium- undKalziumsalzen ausgewählt.Bevorzugt werden als Alkalimetallsalze NaCl und KCl und als ErdalkalimetallsalzeCaCl2 und MgSO4 oderCaCl2 und MgCl2 verwendet.
    [0027] DieAlkalimetallsalze bzw. die Erdalkalimetallsalze können inder isotonischen Gefrierschutzlösunggemäß der vorliegendenErfindung jeweils in folgenden Konzentrationen vorliegen: NaClbevorzugt in einem Bereich von 100-200 mmol/l, und besonders bevorzugtin einer Konzentration von 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170,180, 190 oder 200 mmol/l; KCl bevorzugt in einem Bereich von2.5-15 mmol/l, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 oder 15 mmol/l; MgSO4 bevorzugtin einem Bereich von 1-15 mmol/l, und besonders bevorzugt in einerKonzentration von 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 oder 15 mmol/l; MgCl2 bevorzugt in einem Bereich von 1-15 mmol/l,und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 1, 2.5, 5, 7.5,10, 12.5 oder 15 mmol/l; CaCl2 bevorzugtin einem Bereich von 2.5-10 mmol/l und besonders bevorzugt in einerKonzentration von 2.5, 5, 7.5 oder 10 mmol/l.
    [0028] Inder erfindungsgemäßen isotonischenGefrierschutzlösungist weiterhin eine Puffersubstanz enthalten. Diese Puffersubstanzwird bevorzugt ausgewähltaus einer der Substanzen HEPES, Tris und Triäthanolamin. In einer besondersbevorzugten Ausführungsformliegt die Puffersubstanz in der Gefrierschutzlösung in der folgenden Konzentrationvor: Tris im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 8-9, bevorzugt ineinem Bereich 20-30 mmol/l, pH 8-9, und besonders bevorzugt in einerKonzentration von 20 mmol/l, pH 8-9. HEPES im Bereich von 20-40mmol/l, pH 6-7, bevorzugt in einem Bereich 20-30 mmol/l, pH 6-7,und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 20 mmol/l, pH6-7. Triäthanolaminim Bereich von 20-40 mmol/l, pH 6-8, bevorzugt in einem Bereich20-30 mmol/l, pH 6-8 und besonders bevorzugt in einer Konzentrationvon 20 mmol/l, pH 6-8.
    [0029] Beispielebevorzugter Kombinationen der oben aufgeführten Alkali- und Erdalkalimetallsalzesowie von Puffern in der erfindungsgemäßen isotonischen Gefrierschutzlösung sindim folgenden in Tabelle 1 angegeben.
    [0030] Optionalwird der erfindungsgemäßen isotonischenGefrierschutzlösungNaHCO3 als zusätzliches Salz zugegeben. DieKonzentration von NaHCO3 in der isotonischenGefrierschutzlösungbeträgtvorzugsweise 2.5-15 mmol/l und liegt bevorzugt in einem Bereichvon 5-15 mmol/l, vorzugsweise von 7.5-15 mmol/l oder besonders bevorzugtvon 7.5-12,5 mmol/l. Besonders bevorzugt liegt die Konzentrationvon NaHCO3 in einer Konzentration von 7.5,8, 8.5 9, 9.5 oder 10 mmol/l, und noch bevorzugter in einer Konzentrationvon 10 mmol/l vor.
    [0031] Dieerfindungsgemäße isotonischeGefrierschutzlösungenthältweiterhin eine interne Gefrierschutzsubstanz. Diese interne Gefrierschutzsubstanzist vorzugsweise in der Lage, in die Eier zu diffundieren, um dortdie Eiskristallbildung in den Fischeiern und/oder Fischembryonenzu verhindern. Geeignete Substanzen sind dem Fachmann bekannt. Dieinterne Gefrierschutzsubstanz wird bevorzugt ausgewählt ausmindestens einer der Verbindungen Dimethylazetamid, Dimethylsulfoxid,Glyzerin, Methanol, Polyethylenglykol und/oder Propandiol.
    [0032] Dieinterne Gefrierschutzsubstanz liegt in der isotonischen Gefrierschutzlösung bevorzugtin einer Konzentration von 1-40 Gew.-%, ebenfalls bevorzugt in einerKonzentration von 10-40 Gew.-%, und von 15-40 Gew.-%, 20-40 Gew.-%,25-40 Gew.-%, 30-40Gew.-% oder 35-40 Gew.-% vor, besonders bevorzugt in einer Konzentrationvon 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 oder 40 Gew.-% und am stärksten bevorzugtin einer Konzentration von 40 Gew.-%.
    [0033] Dieinterne Gefrierschutzsubstanz kann in der isotonischen Gefrierschutzlösung auchals Gemisch der oben genannten Verbindungen vorliegen. In einerbesonderen Ausführungsformliegt die interne Gefrierschutzsubstanz als Gemisch der VerbindungenDimethylsulfoxid (DMSO) und Glyzerin, oder Dimethylsulfoxid (DMSO)und Methanol, oder Methanol und Glyzerin vor. In einer weiterenbevorzugten Ausführungsformder vorliegenden Erfindung liegt das Gemisch in folgenden Konzentrationenvor (Endkonzentrationen in der isotonischen Gefrierschutzlösung): Dimethylsulfoxid(DMSO) 10-20 Gew.-% + Glyzerin 5-10 Gew.-%; Dimethylsulfoxid(DMSO) 10-20 Gew.-% + Methanol 5-10 Gew.-%; oder Methanol 10-20Gew.-% + Glyzerin 5-20 Gew.-%.
    [0034] Beispielebesonders bevorzugter Konzentrationen der internen Gefrierschutzsubstanzin der erfindungsgemäßen isotonischenGefrierschutzlösungsind im folgenden in Tabelle 2 angegeben.
    [0035] Dieerfindungsgemäße isotonischeGefrierschutzlösungenthältneben der internen Gefrierschutzsubstanz eine externe Gefrierschutzsubstanz.Diese externe Gefrierschutzsubstanz ist im Unterschied zu der internenGefrierschutzsubstanz bevorzugt nicht in der Lage, in die Fischeierund/oder Fischembryonen zu diffundieren. Die Aufgabe der externenGefrierschutzsubstanz ist der Entzug von Wasser aus den Fischeiern und/oderFischembryonen, was aufgrund des entstehenden osmotischen Gradientenzwischen den Fischeiern und/oder Fischembryonen und ihrer Umgebungermöglichtwird. Die Reduktion von Zellwasser in den Fischeiern und/oder Fischembryonenverhindert die Eiskristallbildung und erleichtert damit das Einfrieren.Weiterhin verhindert der Entzug von Wasser ein Platzen der Zellenwährenddes Schrittes des Einfrierens und ist damit essentiell für das Überlebender Fischeier und/oder Fischembryonen während des Einfrierens und beider Lagerung im gefrorenen Zustand. Geeignete Substanzen sind demFachmann bekannt.
    [0036] Erfindungsgemäß wird dieexterne Gefrierschutzsubstanz vorzugsweise ausgewählt ausmindestens einer der Verbindungen Dextran, Glyzin, Maltose, Saccharose,Glukose, Galaktose und/oder Stärke.
    [0037] Ineiner besonderen Ausführungsformder vorliegenden Erfindung liegt die externe Gefrierschutzsubstanzin der isotonischen Gefrierschutzlösung in einer Konzentrationvon 2,5-10 Gew.-%, bevorzugt in einer Konzentration von 5-10 Gew.-%oder von 7,5-10 Gew.-% vor, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von2,5, 5, 7,5 oder 10 Gew.-%.
    [0038] Besondersbevorzugte Konzentrationen der externen Gefrierschutzsubstanz inder erfindungsgemäßen isotonischenGefrierschutzlösungsind im folgenden in Tabelle 3 angegeben.
    [0039] DieKonzentrationen von internen und externen Gefrierschutzsubstanzenund die Einfrierbedingungen unterliegen einer engen Wechselbeziehung,d.h. die Einfrierbedingungen sind von der Zusammensetzung der isotonischenGefrierschutzlösungabhängigund umgekehrt.
    [0040] DieseWechselbeziehung beruht auf folgenden Grundlagen: Bei niedrigenEinfrierraten frieren Zellen langsamer, durch das langsame Einfrierenwird ihnen mehr Wasser entzogen. Das hier zugrundeliegende physikalischePrinzip beruht auf Kristallisationseffekten des Wassers. Beispielsweiseführenhohe Konzentrationen von internen und externen Gefrierschutzen schonvor dem Einfrieren aufgrund von Osmose zu einem Wasserentzug ausden Zellen. Würdenin diesem Fall zum Einfrieren zusätzlich geringe Einfrierratenverwendet, wird der Wasserentzug so hoch, dass dies für die Zellentödlichsein kann. Bei hohen Konzentrationen von Gefrierschutzen werdendaher bevorzugt hohe Einfrierraten verwendet und umgekehrt.
    [0041] Besondersbevorzugt werden fürdie Gefrierkonservierung im klassischen Sinn die Gefrierschutzsubstanzenin geringeren Konzentrationen verwendet als für die Vitrifikation.
    [0042] DerBegriff „Gefrierkonservierung" soll in der vorliegendenBeschreibung so verstanden werden, dass sowohl die klassische Gefrierkonservierungwie auch die Vitrifikation mit umfasst sind.
    [0043] Dieerfindungsgemäße isotonischeGefrierschutzlösungbesitzt daher in einer besonderen Ausführungsform ein Verhältnis voninterner Gefrierschutzsubstanz zu externer Gefrierschutzsubstanzin der Gefrierschutzlösungvon 10-40 Gew.-% : 5-10 Gew.-%.
    [0044] Besondersbevorzugte Verhältnissevon interner Gefrierschutzsubstanz zu externer Gefrierschutzsubstanzin der Gefrierschutzlösungsind in den folgenden Tabellen 4 und 5 angegeben.
    [0045] Insbesonderewenn die Fischeier und/oder Fischembryonen sensibel gegenüber Abkühlung reagieren undein hohes Temperaturoptimum aufweisen, z.B. bei Warmwasserfischarten,könnenSubstanzen zugegeben werden, die das Eindringen des Gefrierschutzeserleichtern sowie die Zellphysiologie und den Stoffwechsel stabilisieren.Solche Substanzen sind beispielsweise die Energiesubstrate Oxalazetat,Pyruvat, Zitrat, Isozitrat, und Phosphoenolpyruvat. Zur Membranstabilisierungdienen beispielsweise Verbindungen wie Phosphatidylcholin, Cholinund Lysolecithin. Weitere geeignete Substanzen sind dem Fachmannbekannt.
    [0046] Zusätzlich zuden bereits genannten internen und externen Gefrierschutzsubstanzenkann die erfindungsgemäße isotonischeGefrierschutzlösungdaher als Energiesubstrate mindestens eine weitere Verbindung enthaltenausgewähltaus mindestens einer der Verbindungen Oxalazetat, Pyruvat, Zitrat,Isozitrat und/oder Phosphoenolpyruvat.
    [0047] Gemäß einerbesonderen Ausführungsformder vorliegenden Erfindung liegt die weitere Verbindung in der isotonischenGefrierschutzlösungin einer Konzentration von 1-10 mmol/l, bevorzugt in einer Konzentrationvon 2-8 mmol/l oder von 4-6 mmol/l vor, und besonders bevorzugtin einer Konzentration von 4, 5 oder 6 mmol/l. Am stärksten bevorzugtliegt die weitere Verbindung in der isotonischen Gefrierschutzlösung ineiner Konzentration von 5 mmol/l vor.
    [0048] Zusätzlich zuden bereits aufgeführtenmöglichenBestandteilen der erfindungsgemäßen isotonischen Gefrierschutzlösung kanndie erfindungsgemäße isotonischeGefrierschutzlösung,insbesondere zur Membranstabilisierung, ebenfalls mindestens eineweitere Verbindung enthalten ausgewählt aus mindestens einer derVerbindungen Phosphatidylcholin, Cholin und Lysolecithin.
    [0049] Gemäß einerbesonderen Ausführungsformder vorliegenden Erfindung liegt diese weitere Verbindung in derisotonischen Gefrierschutzlösungin einer Konzentration von 0,1 Gew-%, 0,25 Gew-%, 0,5 Gew-%, 1 Gew-%vor.
    [0050] Ineiner Ausführungsformdes erfindungsgemäßen Verfahrenswerden die Fischeier und/oder Fischembryonen in der oben beschriebenenerfindungsgemäßen isotonischenGefrierschutzlösunginkubiert, so dass eine homogene Durchdringung der Fischeier und/oderFischembryonen mit dieser Gefrierschutzlösung erreicht wird.
    [0051] Indiesem Zusammenhang ist fürdie Gefrierkonservierung der Fischeier und/oder Fischembryonen dasVerhältnisvon Fischeiern und/oder Fischembryonen zu der isotonischen Gefrierschutzlösung vonbesonderer Bedeutung, um eine Durchdringung der Fischeier und/oderFischembryonen mit der internen Gefrierschutzsubstanz zu gewährleisten.Das Verhältnisvon isotonischer Gefrierschutzlösungzu Fischei und/oder Fischembryo beträgt vorzugsweise 1 – 2 g Fischei-und/oder Fischembryogewebe pro 5 ml der isotonischen Gefrierschutzlösung. Dadie Fischeier und/oder Fischembryonen empfindliche Objekte darstellen,werden sie mit speziellen Netzeinsätzen, die beispielhaft in 1 dargestelltsind, in die isotonische Gefrierschutzlösung eingebracht. Diese Netzeinsätze werdenauch dazu verwendet, um die Fischeier und/oder Fischembryonen von einerisotonischen Gefrierschutzlösungin eine andere isotonische Gefrierschutzlösung zu überführen.
    [0052] Vorzugsweisewerdenin einem weiteren Schritt die nach dem ersten Schritt erhaltenenFischeier und/oder Fischembryonen in mindestens einer weiteren erfindungsgemäßen Gefrierschutzlösung inkubiert, dieeine höhereKonzentration, insbesondere an internen und/oder externen Gefrierschutzsubstanzen,als die im ersten Schritt verwendete Gefrierschutzlösung besitzt.
    [0053] Besondersvorteilhaft zur erfolgreichen Gefrierkonservierung von Fischeiernund/oder Fischembryonen ist dabei, eine homogene Durchdringung (Permeation)der Fischeier und/oder Fischembryonen mit der internen Gefrierschutzsubstanzzu erzielen.
    [0054] Umdiese homogene Durchdringung zu erreichen werden die Fischeier und/oderFischembryonen vorzugsweise zunächstnacheinander in einer Serie von isotonischen Gefrierschutzlösungen inkubiert,die die internen und externen Gefrierschutzsubstanzen in aufsteigendenKonzentrationen enthalten. Beginnend mit einer Konzentration bevorzugtvon 5 Gew.-% wird die Konzentration der internen Gefrierschutzsubstanzin der isotonischen Gefrierschutzlösung in Intervallen bevorzugtvon 5 Gew.-% auf die gewünschteEndkonzentration erhöht.Beispiele bevorzugter Endkonzentrationen sind in Tabelle 2 dargestellt.Anschließendwird die Konzentration der externen Gefrierschutzsubstanz in derisotonischen Gefrierschutzlösungerhöht.Die Ausgangskonzentration fürdie externe Gefrierschutzsubstanz beträgt dabei bevorzugt 2,5 Gew.-%,das Konzentrationsintervall, mit dem die Konzentration stufenweiseerhöhtwird, beträgtebenfalls bevorzugt 2,5 Gew.-%.
    [0055] Dasphysikalische Umfeld fürVerringerung der Konzentrationen der internen und externen Gefrierschutzsubstanzenkann bei der Inkubation variiert werden. Bevorzugt findet das Inkubierenbei einem Druck zwischen 250 bar und Normaldruck, bei einer Temperaturzwischen –4°C und 20°C und über einenZeitraum von 5 bis 20 min statt. Entsprechend der Empfindlichkeitder Fischeier und/oder Fischembryonen wird die Inkubation besondersbevorzugt auf folgende Weise variiert. Diese Modifikationen beruhenauf der Kenntnis, dass die Vitalfunktionen der Eier und Embryonenumso weniger beeinflusst werden, je geringer die Temperatur undder ausgeübteDruck sind. Die sogenannte "ultraslowequilibration" wirdbei Normaldruck, –4°C (supercooling)und Inkubationszeiten von 20 min je Konzentrationsgradient durchgeführt, undfür sehr empfindlicheEier und Embryonen eingesetzt. Die sogenannte „slow equilibration" wird bei Normaldruck,4°C undInkubationszeiten von 15 min je Konzentrationsgradient durchgeführt, diesogenannte „lowspeed equilibration" bei 15-20°C, Normaldruckund Inkubationszeiten von 10 min je Konzentrationsgradient durchgeführt. Diesogenannte „highspeed equlibration" wirdbei erhöhtemDruck von 250 – 500bar in Druckkammern, 15-20°Cund Inkubationszeiten von 5 min je Konzentrationsgradient durchgeführt. DerAufbau einer Druckkammer ist beispielhaft in 2 dargestellt.
    [0056] BeiFischeiern und/oder Fischembryonen mit extrem undurchlässiger Eischaleund Zellmembran könnendie Fischeier und/oder Fischembryonen vor der Inkubation in dererfindungsgemäßen Gefrierschutzlösung mitbiologischen Detergentien permeabilisiert werden. Dies stellt eineSonderform der Permeabilisierung für Eier und Embryonen mit sehrundurchlässigerEischale und Zellmembran dar.
    [0057] GeeigneteDetergenzien sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugte Detergenzienfür diePermeabilisierung werden ausgewähltaus 3-[(3-Cholamicopropyl)-dimethylammonium]-2-hydroxypropansulfonat (CHAPSO), Glyocholsäure, Dodecyltrimethylammoniumbromidoder Triton X100.
    [0058] Bevorzugtliegen die Detergenzien zur Permeabilisierung in der isotonischenGefrierschutzlösungin einer Konzentration von 0,001-0,01 Gew.-% vor, besonders bevorzugtin einer Konzentration von 0,004-0,006 Gew.-% und noch bevorzugterin einer Konzentration von 0,005 Gew.-%.
    [0059] Ineiner weiteren Ausführungsformder vorliegenden Erfindung erfolgt die Inkubation der 9Fischeierin der erfindungsgemäßen Gefrierschutzlösung imStadium der Quellung und Wasserhärtung.Dabei werden die Fischeier bevorzugt befruchtet und anschließend, wiein der Aquakultur üblich,zur Quellung und Schalenaushärtungin Wasser inkubiert. Wird dem Wasser die isotonische Gefrierschutzlösung zugegeben,kann die interne Gefrierschutzsubstanz aufgrund der Quellung passivin den perivitellinen Spalt und von dort in das Innere des Eis gelangen.Alternativ könnendie Eier direkt in die isotonische Gefrierschutzlösung gebrachtwerden. Dieses Verfahren wird bevorzugt für Eier von Süßwasserfischenangewendet, die >20%ihres Gesamtgewichts an Wasser aufnehmen.
    [0060] Einealternative Ausführungsformder vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Konservierungvon Fischeiern und/oder Fischembryonen, wobei die erfindungsgemäße Gefrierschutzlösung indie Fischeier und/oder Fischembryonen bevorzugt über eine Mikroinjektion soin die Fischeier und/oder Fischembryonen eingebracht wird, dasseine homogene Durchdringung der Fischeier und/oder Fischembryonenmit der erfindungsgemäßen isotonischenGefrierschutzlösungerreicht wird.
    [0061] DieseAusführungsformist insbesondere fürFischeier und/oder Fischembryonen mit extrem undurchlässiger Eischaleund Zellmembran geeignet. Die erfindungsgemäße Gefrierschutzlösung wirddabei in die Fischeier und/oder Fischembryonen bevorzugt mittelsMikrospritzen entsprechend den gewünschten und in Tabelle 1 dargestelltenEndkonzentrationen injiziert. Dieses Verfahren kann bevorzugt für Artenmit großenEiern, und noch stärkerbevorzugt bei Salmoniden, angewandt werden.
    [0062] Bevorzugtwerden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren für Meeresfischeund Süßwasserfischeder Ordnung Teleoster eingesetzt.
    [0063] ImAnschluß andie oben dargestellten erfindungsgemäßen Verfahren zur Konservierungvon Fischeiern und/oder Fischembryonen werden in einem anschließenden Schrittdie mit der erfindungsgemäßen isotonischenGefrierschutzlösunginjizierten und/oder inkubierten Fischeier und/oder Fischembryonenin der Regel eingefroren.
    [0064] ZumEinfrieren werden die Fischeier und/oder Fischembryonen bevorzugtin Gefäße verpacktund in diesen Gefäßen eingefroren.Dabei stehen bevorzugt die folgenden zwei Verfahren zur Auswahl.
    [0065] Einerseitskann das Einfrieren der Fischeier und/oder Fischembryonen in derisotonischen Gefrierschutzlösungerfolgen. Die die Fischeier und/oder Fischembryonen umgebende isotonischeGefrierschutzlösungwird dabei vor dem Einfrieren nicht entfernt. Zum Einfrieren derFischeier und/oder Fischembryonen werden bevorzugt handelsübliche 0,5 – 1,2 mlPailletten verwendet. Alternativ werden die Fischeier und/oder Fischembryonenin Pellets eingefroren.
    [0066] Umdas Gesamtvolumen des Einfriergutes zu verringern und in den Fischeiernund/oder Fischembryonen homogenere Einfrierraten zu erzielen, kannandererseits die die Fischeier und/oder Fischembryonen umgebendeisotonische Gefrierschutzlösungvor dem Einfrieren entfernt werden, d.h. die Fischeier und/oderFischembryonen werden im „trockenen" Zustand eingefroren.Zum Einfrieren könnendie Fischeier und/oder Fischembryonen bevorzugt in den in 1 beschriebenenNetzeinsätzendirekt in den Stickstoffdampf bzw. in den Flüssigstickstoff eingebrachtwerden. Dieses Einfrierverfahren wird bevorzugt für wasserreicheEmbryonen und fürgroßeFischeier und/oder Fischembryonen eingesetzt.
    [0067] DasEinfrieren der Eier und Embryonen nach jedem der beiden Verfahrenkann in einem sogenannten offenen System im Dampf von Flüssigstickstoffoder durch direkte Immersion in Flüssigstickstoff stattfinden. DasEinfrieren im Dampf von Flüssigstickstoffwird per Definition als „klassischeGefrierkonservierung" bezeichnet,die Immersion in Flüssigstickstoff,die mit sehr hohen Einfrierraten verbunden ist, als „Vitrifikation".
    [0068] Dasfür dievorliegende Erfindung eingesetzte offene System ist schematischin 3 dargestellt.
    [0069] Bevorzugtbesteht das System aus einer Kühlboxzur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen, die eineKammer 1 mit Deckel 2 und eine über demBoden angebrachte Überlaufvorrichtung 3 besitzt,wobei die Kammer 1 von einer Isolierung 4 undeiner Außenschicht 5 umgebenist und sich in der Kammer 1 eine in vertikaler Richtungverstellbare Hebevorrichtung 6 befindet. Bevorzugt besitztdie Hebevorrichtung 6 einen Rost 7 zum Auflegenvon Gefriergut.
    [0070] Nochbevorzugter ist die Kühlboxdickwandig isoliert. In einer Ausführungsform der vorliegendenErfindung betragen die Innendimensionen dieser Kühlbox 37 × 28 × 43 cm (Länge × Breite × Höhe). 4 cm über dem Boden besitzt dieseKiste vorzugsweise ein Überlaufrohrmit einem Überlaufventil.Bis zu diesem Überlaufrohrkann die Kühlboxmit Flüssigstickstoffbefälltwerden. Die in der Kammer 1 angebrachte in vertikaler Richtungverstellbare Hebevorrichtung 6 kann bevorzugt stufenlosin vertikaler Richtung justiert werden. Unterschiedliche Abstände derverstellbaren Hebevorrichtung 6 und des optional auf demRost 7 aufgebrachten Gefriergutes vom Flüssigstickstoffspiegelbedingen verschiedene Einfriertemperaturen und damit unterschiedlicheEinfrierraten. Zusätzlichkann der Rost 7 mechanisch mit einer Geschwindigkeit von2 – 10mm/min abgesenkt werden, um spezifische Einfrierraten festzulegen.Zur Vitrifikation wird das Einfriergut vorzugsweise direkt in Flüssigstickstoffeingebracht. Fürdie klassische Gefrierkonservierung wird das Einfriergut dagegen vorzugsweise über demFlüssigstickstoffspiegelim Dampf des Flüssigstickstoffsgehalten. Fürdie Lagerung des Stickstoffs könnendie gängigen,einem Fachmann bekannten Stickstofflagerungsbehälter verwendet werden.
    [0071] Habendie Fischeier und/oder Fischembryonen die bevorzugte Einfriertemperaturerreicht, ist der Einfriervorgang abgeschlossen.
    [0072] NachAbschluß derEinfrierphase könnendie eingefrorenen Fischeier und/oder Fischembryonen in Kühlmittelnoder Kühlvorrichtungengelagert werden. Besonders bevorzugtes Kühlmittel für die Lagerung ist flüssiger Stickstoff.Als Kühlvorrichtungkönnenalle im Stand der Technik bekannten Kühlvorrichtungen eingesetztwerden.
    [0073] Nachdem Verfahren der vorliegenden Erfindung konservierte und eingefroreneFischeier sind nahezu unbegrenzt stabil. Theoretisch wird heutemit einer Abnahme der Vitalitätbei einer Lagerung im Bereich von Millionen von Jahren spekuliert.
    [0074] NachAbschluß desEinfriervorganges und optional nach einer Lagerung in einem Kühlmitteloder einer Kühlvorrichtungkönnendie eingefrorenen Fischeier und/oder Fischembryonen wieder aufgetautwerden.
    [0075] DasAuftauen findet vorzugsweise für10 – 30sec in einem 30 – 40°C statt undkann dabei vorzugsweise nach folgenden Verfahren erfolgen.
    [0076] Fischeierund/oder Fischembryonen, die zusammen mit der isotonischen Gefrierschutzlösung inPailletten eingefroren wurden, werden vorzugsweise dadurch aufgetaut,dass die Pailletten, enthaltend die Fischeier und/oder Fischembryonen,vorzugsweise für10 – 30sec in einem 30 – 40°C in einemwarmem Wasserbad erwärmtwerden.
    [0077] Fischeierund/oder Fischembryonen, die in Netzeinsätzen unter Entfernung des sieumgebenden isotonischen Gefrierschutzmittels eingefroren wurden,werden bevorzugt in der entsprechenden isotonischen Gefrierschutzlösung aufgetaut,in der sie vor dem Einfrieren inkubiert wurden. Bevorzugt werdendie Fischeier und/oder Fischembryonen dabei zunächst in die isotonische Gefrierschutzlösung gegeben.Anschließendwird die isotonische Gefrierschutzlösung vorzugsweise für 10 – 30 secauf 30-40°Cerwärmt.
    [0078] Nachdem Auftauen der Fischeier und/oder Fischembryonen werden in einemoptionalen weiteren Schritt die externen und die internen Gefrierschutzsubstanzenaus den Fischeiern und/oder Fischembryonen entfernt. Das möglichstvollständigeEntfernen der Gefrierschutzsubstanzen stellt einen wichtigen Vorgangdar, um die Lebensfähigkeitder aufgetauten Fischeier und/oder Fischembryonen zu optimieren,da die Gefrierschutzsubstanzen auf die Fischeier und/oder Fischembryonenbei Langzeitexposition im aufgetauten Zustand toxisch wirken können.
    [0079] DieEntfernung der Gefrierschutzsubstanzen erfolgt bevorzugt durch stufenweiseVerringerung der Konzentrationen der externen und der internen Gefrierschutzsubstanzenaus den Fischeiern und/oder Fischembryonen ähnlich zu jenem erfindungsgemäßen Verfahren,das zur Inkubation der Fischeier und/oder Fischembryonen in denexternen und der internen Gefrierschutzsubstanzen angewendet wurde.
    [0080] DieFischeier und/oder Fischembryonen werden dazu zunächst nacheinanderin mindestens einer isotonischen Gefrierschutzlösung, bevorzugt in einer Serievon isotonischen Gefrierschutzlösungeninkubiert, die die internen und externen Gefrierschutzsubstanzenin absteigenden Konzentrationen enthalten. Beginnend mit der höchsten Konzentrationwird zunächstdie Konzentration der externen Gefrierschutzsubstanz in Intervallenbevorzugt von 2,5 Gew.-% bis auf etwa 0 Gew.-% verringert. Anschließend wirddie Konzentration der internen Gefrierschutzsubstanz in der isotonischenGefrierschutzlösungin Intervallen bevorzugt von 5 Gew.-% bis auf etwa 0 Gew.-% verringert.
    [0081] Dasphysikalische Umfeld fürVerringerung der Konzentrationen der internen und externen Gefrierschutzsubstanzenkann bei der Inkubation variiert werden. Bevorzugt findet das Inkubierenbei einem Druck zwischen Normaldruck und partiellem Vakuum bei 0,1 – 1 mbar,bei einer Temperatur zwischen –4°C und 20°C und über einenZeitraum von 5 bis 20 min je Schritt zur Konzentrationserniedrigungstatt. Entsprechend der Empfindlichkeit der Fischeier und/oder Fischembryonenwird das physikalische Umfeld besonders bevorzugt auf folgende Weisevariiert. Die sogenannte "ultraslowcryoprotectant removal method" wirdbei Normaldruck, –4°C (supercooling)und Inkubationszeiten von 20 min je Konzentrationsgradient durchgeführt, undfür sehr empfindlicheEier und Embryonen angewandt. Die sogenannte „slow cryoprotectant removalmethod" wird bei Normaldruck,4°C undInkubationszeiten von 15 min je Konzentrationsgradient durchgeführt, diesogenannte „lowspeed cryoprotectant removal method" bei 15-20°C, Normaldruck und Inkubationszeitenvon 10 min je Konzentrationsgradient durchgeführt, und die sogenannte „high speedpenetration" beipartiellem Vakuum von 0,1 bis 1 mbar in Wasserstrahlvakuumpumpen.
    [0082] Durchdie Gefrierkonservierung könnenan Fischeiern und/oder Fischembryonen Schädigungen morphologischer, physiologischerund metabolischer Natur entstehen. Da Fischeier und/oder Embryonenmultipotente noch nicht ausdifferenzierte Zellen oder Zellverbände darstellen,könnendie Verletzungen in der Regel gut kompensiert werden. Um die AusbeutelebensfähigerFischeier und/oder Fischembryonen zu erhöhen und um ein Absterben inspäterenEntwicklungsstadien zu verhindern, können optional nach dem Auftauender Fischeier und/oder Fischembryonen nach dem erfindungsgemäßen VerfahrenRevitalisierungstechniken angewendet werden. Dabei werden die Fischeierund/oder Fischembryonen bevorzugt nach dem Auftauen und dem Entfernender Gefrierschutzsubstanzen nicht sofort in Süßwasser bzw. Meerwasser inden Erbrütungseinheitenvon Fischzuchten weitererbrütet,sondern in einem speziellen Verfahren revitalisiert. Dazu werden siein einer isotonischen Revitalisierungslösung inkubiert. Die isotonischeRevitalisierungslösungenthältbevorzugt ein Alkalimetallsalz und/oder ein Erdalkalimetallsalzund eine Puffersubstanz.
    [0083] Gemäß einerAusführungsformder vorliegenden Erfindung wird das Alkalimetallsalz aus Natrium-und Kaliumsalzen und das Erdalkalimetallsalz aus Magnesium- und Kalziumsalzenausgewählt.Bevorzugt werden als Alkalimetallsalze NaCl und KCl und als ErdalkalimetallsalzeCaCl2 und MgSO4 oderCaCl2 und MgCl2 verwendet.
    [0084] DieAlkalimetallsalze bzw. die Erdalkalimetallsalze können inder isotonischen Revitalisierungslösung gemäß der vorliegenden Erfindungjeweils in folgenden Konzentrationen vorliegen: NaCl bevorzugtin einem Bereich von 100-200 mmol/l, und besonders bevorzugt ineiner Konzentration von 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170,180, 190 oder 200 mmol/l; KCl bevorzugt in einem Bereich von2.5-15 mmol/l, und besonders bevorzugt in einer Konzentration von2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 oder 15 mmol/l; MgSO4 bevorzugtin einem Bereich von 1-15 mmol/l, und besonders bevorzugt in einerKonzentration von 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 oder 15 mmol/l; MgCl2 bevorzugt in einem Bereich von 1-15 mmol/l,und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 1, 2.5, 5, 7.5,10, 12.5 oder 15 mmol/l; CaCl2 bevorzugtin einem Bereich von 2.5-10 mmol/l und besonders bevorzugt in einerKonzentration von 2.5, 5, 7.5 oder 10 mmol/l.
    [0085] Inder erfindungsgemäßen isotonischenLösungist weiterhin eine Puffersubstanz enthalten. Diese Puffersubstanzwird bevorzugt ausgewähltaus einer der Substanzen HEPES, Tris und Triäthanolamin. In einer besondersbevorzugten Ausführungsformliegt die Puffersubstanz in der isotonischen Revitalisierungslösung inder folgenden Konzentration vor: Tris im Bereich von 20-40mmol/l, pH 8-9, bevorzugt in einem Bereich 20-30 mmol/l, pH 8-9,und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 20 mmol/l, pH8-9. HEPES im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 6-7, bevorzugt ineinem Bereich 20-30 mmol/l, pH 6-7, und besonders bevorzugt in einerKonzentration von 20 mmol/l, pH 6-7. Triäthanolamin im Bereich von 20-40mmol/l, pH 6-8, bevorzugt in einem Bereich 20-30 mmol/l, pH 6-8und besonders bevorzugt in einer Konzentration von 20 mmol/l, pH6-8.
    [0086] Beispielebevorzugter Kombinationen der oben aufgeführten Alkali- und Erdalkalimetallsalzesowie von Puffern in der erfindungsgemäßen isotonischen Revitalisierungslösung sindim folgenden in Tabelle 6 angegeben.
    [0087] DieInkubationstemperatur beim Revitalisieren ist bevorzugt das demEityp entsprechende Temperaturoptimum. Das Temperaturoptimum istbei den jeweiligen Arten unterschiedlich und unterscheidet sichvon Spezies zu Spezies. Bei Kaltwasserarten liegt das Temperaturoptimumbeispielsweise bei 4-15°C,bei Warmwasserarten bei >15-30 °C.
    [0088] BeiKaltwasserarten erfolgt die Inkubation 48 h lang, bei Warmwasserarten24 h. Eine Belüftungdes Inkubationsmediums mittels gängigerLuftpumpen und Ausströmerist notwendig, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung der Fischeierund/oder Fischembryonen zu gewährleisten.Die Inkubationsdichte beträgt1 – 2g Ei- bzw. Embryogewebe pro 5 ml isotonischer Revitalisierungslösung. BeiFischarten, deren Eier eine sehr kurze Embryonalzeit haben und diedemzufolge eine hohe Stoffwechselrate aufweisen, können beider Revitalisierung Energiesubstrate zugegeben werden. Bevorzugtwerden die Energiesubstrate ausgewählt aus Oxalazetat, Pyruvatund/oder Zitrat. Die Energiesubstrate werden vorzugsweise in einerKonzentration von 1-10 mmol/l, bevorzugt in einer Konzentrationvon 2-8 mmol/l oder von 4-6 mmol/l eingesetzt, und besonders bevorzugtin einer Konzentration von 4, 5 oder 6 mmol/l. Am stärksten bevorzugtwird das Energiesubstrat in einer Konzentration von 5 mmol/l eingesetzt.
    [0089] Nachder Inkubation der Fischeier und/oder Fischembryonen in der isotonischenRevitalisierungslösungist das Revitalisierungsverfahren abgeschlossen. Die Fischeier und/oderFischembryonen könnenanschließendin den Erbrütungseinheitenvon Fischzuchten in Süßwasseroder Meerwasser weitergebrütetwerden. Alternativ könnendie Fischeier und/oder Fischembryonen jeder beliebigen anderen Verwendungzugeführtwerden.
    权利要求:
    Claims (55)
    [1] Isotonische Gefrierschutzlösung zur Konservierung vonFischeiern und/oder Fischembryonen enthaltend: e) ein Alkalimetallsalzund/oder ein Erdalkalimetallsalz; f) eine interne Gefrierschutzsubstanz,die in der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zudiffundieren; g) eine externe Gefrierschutzsubstanz, die nichtin der Lage ist, in die Fischeier und/oder Fischembryonen zu diffundieren,und h) eine Puffersubstanz.
    [2] Gefrierschutzlösungnach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalimetallsalzaus Natrium- und Kaliumsalzen und das Erdalkalimetallsalz aus Magnesium-und Kalziumsalzen ausgewähltwird.
    [3] Gefrierschutzlösungnach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als AlkalimetallsalzeNaCl und KCl und als Erdalkalimetallsalze CaCl2 undMgSO4 oder CaCl2 undMgCl2 verwendet werden.
    [4] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkalimetallsalz bzw. dasErdalkalimetallsalz in der Gefrierschutzlösung wie folgt vorliegt: NaClin einem Bereich von 100-200 mmol/l, und/oder KCl in einemBereich von 2,5-15 mmol/l, und/oder MgSO4 ineinem Bereich von 1-15 mmol/l, und/oder MgCl2 ineinem Bereich von 1-15 mmol/l, und/oder CaCl2 ineinem Bereich von 2,5-10 mmol/l.
    [5] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-4, dadurch gekennzeichnet, dass NaHCO3 alszusätzlichesSalz enthalten ist.
    [6] Gefrierschutzlösungnach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentrationvon NaHCO3 in der Gefrierschutzlösung 2,5-10mmol/l beträgt.
    [7] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die interne Gefrierschutzsubstanzausgewähltwird aus Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Glyzerin, Methanol,Polyethylenglykol und Propandiol.
    [8] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-7, dadurch gekennzeichnet, dass die interne Gefrierschutzsubstanzin der Gefrierschutzlösungin folgender Konzentration vorliegt: Dimethylacetamid (DMA)10-40 Gew.-%, und/oder Dimethylsulfoxid (DMSO) 10-40 Gew.-%,und/oder Glyzerin 5-25 Gew.-%, und/oder Methanol 10-40Gew.-%, und/oder Polyethylenglykol 10-40 Gew.-%, und/oder Propandiol10-40 Gew.-%.
    [9] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-8, dadurch gekennzeichnet, dass die interne Gefrierschutzsubstanzals Gemisch in folgenden Konzentrationen vorliegt: Dimethylsulfoxid(DMSO) 10-20 Gew.-% + Glyzerin 5-10 Gew.-%, und/oder Dimethylsulfoxid(DMSO) 10-20 Gew.-% + Methanol 5-10 Gew.-%, und/oder Methanol10-20 Gew.-% + Glyzerin 10-20 Gew.-%.
    [10] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-9, dadurch gekennzeichnet dass die externe Gefrierschutzsubstanzausgewähltwird aus Dextran, Glyzin, Maltose, Saccharose, Glukose, Galaktoseund Stärke.
    [11] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die externe Gefrierschutzsubstanzin der Gefrierschutzlösungin einer Konzentration von 2,5-10 Gew.-% vorliegt.
    [12] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-11, dadurch gekennzeichnet, dass die Gefrierschutzlösung zusätzlich mindestenseine weitere Verbindung enthältausgewähltaus Oxalazetat, Pyruvat, Zitrat, Isozitrat und Phosphoenolpyruvat.
    [13] Gefrierschutzlösungnach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Verbindungin der Gefrierschutzlösungin einer Konzentration von 5 mmol/l vorliegt.
    [14] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-12, dadurch gekennzeichnet dass die Gefrierschutzlösung zusätzlich mindestenseine weitere Verbindung enthältausgewähltaus Phosphatidylcholin, Cholin und Lysolecithin.
    [15] Gefrierschutzlösungnach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet dass die weitere Verbindungin der Gefrierschutzlösungin einer Konzentration von 0,1 – 1Gew.-% vorliegt
    [16] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-15, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von interner Gefrierschutzsubstanzzu externer Gefrierschutzsubstanz in der Gefrierschutzlösung 10-40 Gew.-%: 5-10 Gew.-% beträgt.
    [17] Gefrierschutzlösungnach einem der Ansprüche1-16, dadurch gekennzeichnet, dass die Puffersubstanz aus HEPES,Tris und/oder Trisethanolamin ausgewählt wird.
    [18] Gefrierschutzlösungnach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Puffersubstanzin der Gefrierschutzlösungwie folgt vorliegt: Tris im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 8-9;und/oder HEPES im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 6-7; und/oder Triäthanolaminim Bereich von 20-40 mmol/l, pH 6-8.
    [19] Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oderFischembryonen umfassend folgende Schritte: a) Inkubieren derFischeier und/oder Fischembryonen in einer Gefrierschutzlösung gemäß einemder Ansprüche1-18, so dass eine homogene Durchdringung der Fischeier und/oderFischembryonen mit dieser Gefrierschutzlösung erreicht wird; b)Inkubieren der nach Schritt a) erhaltenen Fischeier und/oder Fischembryonenin mindestens einer weiteren Gefrierschutzlösung gemäß einem der Ansprüche 1-18,die eine höhereKonzentration als die unter Schritt a) verwendete Gefrierschutzlösung besitzt;und c) Einfrieren der unter Schritt b) inkubierten Fischeierund/oder Fischembryonen.
    [20] Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet,dass die Fischeier und/oder Fischembryonen vor dem Inkubieren inder Gefrierschutzlösungmit mindestens einem Detergenz permeabilisiert werden.
    [21] Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet,dass das Detergenz ausgewähltwird aus (3-[(3-Cholamicopropyl)-dimethylammonium]-2-hydroxypropansulfonat(CHAPSO), Glykocholsäure,Dodecyltrimethylammoniumbromid und Triton X-100.
    [22] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-21, dadurch gekennzeichnet,dass die Fischeier im Stadium der Quellung und Wasserhärtung indie Gefrierschutzlösunggegeben werden.
    [23] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-22, dadurch gekennzeichnet,dass das Inkubieren bei einem Druck zwischen 250 bar und Normaldruck,bei einer Temperatur zwischen –4°C und 20°C und über einenZeitraum von 5 bis 20 min jeweils im Schritt a) und b) durchgeführt wird.
    [24] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-23, dadurch gekennzeichnet,dass das Inkubieren bei Normaldruck, –4°C und über einen Zeitraum von mindestens20 min jeweils im Schritt a) und b) durchgeführt wird.
    [25] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-23, dadurch gekennzeichnet,dass das Inkubieren bei Normaldruck, 4°C und über einen Zeitraum von mindestens15 min jeweils im Schritt a) und b) durchgeführt wird.
    [26] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-23, dadurch gekennzeichnet,dass das Inkubieren bei Normaldruck, 15-20°C und über einen Zeitraum von mindestens10 min jeweils im Schritt a) und b) durchgeführt wird.
    [27] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-23, dadurch gekennzeichnet,dass das Inkubieren bei 250-500 bar in einer Druckkammer, bei 15-20°C und über einenZeitraum von mindestens 5 min jeweils im Schritt a) und b) durchgeführt wird.
    [28] Verfahren zur Konservierung von Fischeiern und/oderFischembryonen umfassend folgende Schritte: a) Mikroinjektionvon Fischeiern und/oder Fischembryonen mit einer Gefrierschutzlösung gemäß einemder Ansprüche1-18, so dass eine homogene Durchdringung der Fischeier und/oderFischembryonen mit dieser Gefrierschutzlösung erreicht wird; und b)Einfrieren der unter Schritt a) mikroinjizierten Fischeier und/oderFischembryonen.
    [29] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-28, dadurch gekennzeichnet,dass vor dem Einfrieren die die Fischeier und/oder Fischembryonenumgebende Gefrierschutzlösungentfernt wird.
    [30] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-28, dadurch gekennzeichnet,dass vor dem Einfrieren die die Fischeier und/oder Fischembryonenumgebende Gefrierschutzlösungnicht entfernt wird.
    [31] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-30, dadurch gekennzeichnet,dass die Fischeier und/oder Fischembryonen im Stickstoffdampf oderin flüssigemStickstoff eingefroren werden.
    [32] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-31, dadurch gekennzeichnet,dass die eingefrorenen Fischeier und/oder Fischembryonen in Flüssigstickstoffgelagert werden.
    [33] Verfahren zum Auftauen von Fischeiern und/oder Fischembryonen,die nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 19-32 eingefroren wurden,umfassend folgenden Schritt: a) Erwärmen der eingefrorenen Fischeierund/oder Fischembryonen 10-30sec auf 30-40°C.
    [34] Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet,dass nach dem Auftauen die externe und die interne Gefrierschutzsubstanzaus den Fischeiern und/oder Fischembryonen durch stufenweise Verringerung derKonzentrationen der Gefrierschutzsubstanzen entfernt wird.
    [35] Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet,dass die stufenweise Verringerung der Konzentrationen der Gefrierschutzsubstanzendurch Inkubieren der Fischeier und/oder Fischembryonen mit mindestenseiner Gefrierschutzlösunggemäß einemder Ansprüche1-18 durchgeführtwird, die eine niedrigere Konzentration an internen und externenGefrierschutzsubstanzen besitzt als die zum Einfrieren verwendete Gefrierschutzlösung.
    [36] Verfahren nach einem der Ansprüche 34-35, dadurch gekennzeichnet,dass die Konzentration der internen Gefrierschutzsubstanz in denFischeiern und/oder Fischembryonen in 5% Schritten und die der externenGefrierschutzsubstanz in 2,5% Schritten reduziert wird, wobei dieKonzentration der internen und die der externen Gefrierschutzsubstanzstufenweise bis auf 0% reduziert wird.
    [37] Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet,dass das Inkubieren bei einem Druck zwischen Normaldruck und partiellemVakuum bei 0,1 – 1mbar, bei einer Temperatur zwischen –4°C und 20°C und über einen Zeitraum von 5 bis20 min je Schritt zur Konzentrationserniedrigung durchgeführt wird.
    [38] Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet,dass das Inkubieren bei Normaldruck, bei –4°C und über einen Zeitraum von mindestens20 min je Schritt zur Konzentrationserniedrigung durchgeführt wird.
    [39] Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet,dass das Inkubieren bei Normaldruck, bei 4°C und über einen Zeitraum von mindestens15 min je Schritt zur Konzentrationserniedrigung durchgeführt wird.
    [40] Verfahren nach Anspruch 37 dadurch gekennzeichnet,dass das Inkubieren bei Normaldruck, bei 15-20°C und über einen Zeitraum von mindestens10 min je Schritt zur Konzentrationserniedrigung durchgeführt wird.
    [41] Verfahren nach Anspruch 37 dadurch gekennzeichnet,dass das Inkubieren bei partiellem Vakuum bei 0,1 – 1 mbar,bei 15-20°Cund übereinen Zeitraum von mindestens 5 min je Schritt zur Konzentrationserniedrigungdurchgeführtwird.
    [42] Verfahren zum Revitalisieren von Fischeiern und/oderFischembryonen, die nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 33-41aufgetaut wurden, umfassend das Einstellen der gewünschtenEndkonzentration an internen und externen Gefrierschutzsubstanzenin den Fischeiern und/oder Fischembryonen und Inkubieren der Fischeierund/oder Fischembryonen in einer isotonischen Revitalisierungslösung.
    [43] Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet,dass die isotonische Revitalisierungslösung enthält: a) ein Alkalimetallsalzund/oder ein Erdalkalimetallsalz; und b) eine Puffersubstanz.
    [44] Verfahren nach Anspruch 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet,dass das Alkalimetallsalz aus Natrium- und Kaliumsalzen und dasErdalkalimetallsalz aus Magnesium- und Kalziumsalzen ausgewählt wird.
    [45] Verfahren nach Anspruch 43 oder 44, dadurch gekennzeichnet,dass als Alkalimetallsalze NaCl und KCl und als ErdalkalimetallsalzeCaCl2 und MgSO4 oderCaCl2 und MgCl2 verwendetwerden.
    [46] Verfahren nach einem der Ansprüche 43-45, dadurch gekennzeichnet,dass das Alkalimetallsalz bzw. das Erdalkalimetallsalz in der isotonischenRevitalisierungslösungwie folgt vorliegt: NaCl in einem Bereich von 100-200 mmol/l,und/oder KCl in einem Bereich von 2,5-15 mmol/l, und/oder MgSO4 in einem Bereich von 1-15 mmol/l, und/oder MgCl2 in einem Bereich von 1-15 mmol/l, und/oder CaCl2 in einem Bereich von 2,5-10 mmol/l.
    [47] Verfahren nach einem der Ansprüche 43-46, dadurch gekennzeichnet,dass NaHCO3 als zusätzliches Salz enthalten ist.
    [48] Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet,dass die Konzentration von NaHCO3 in derisotonischen Revitalisierungslösung2,5-10 mmol/l beträgt.
    [49] Verfahren nach einem der Ansprüche 43-48, dadurch gekennzeichnet,dass die Puffersubstanz aus HEPES, Tris und/oder Triäthanolaminausgewähltwird.
    [50] Verfahren nach einem der Ansprüche 43-49, dadurch gekennzeichnet,dass die Puffersubstanz in der isotonischen Revitalisierungslösung wiefolgt vorliegt: Tris im Bereich von 20-40 mmol/l, pH 8-9; und/oder HEPESim Bereich von 20-40 mmol/l, pH 6-7; und/oder Triäthanolaminim Bereich von 20-40 mmol/l, pH 6-8.
    [51] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-50, dadurch gekennzeichnet,dass die Inkubationsdichte 1-2 g Fischei und/oder Fischembryogewebepro 5 ml isotonischer Gefrierschutzlösung oder isotonischer Revitalisierungslösung beträgt.
    [52] Verfahren nach einem der Ansprüche 19-51, dadurch gekennzeichnet,dass die Fischeier und/oder Fischembryonen von Süßwasserfischen oder Meerwasserfischenstammen.
    [53] Verwendung einer Gefrierschutzlösung nach einem der Ansprüche 1-18zur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen.
    [54] Kühlboxzur Konservierung von Fischeiern und/oder Fischembryonen bestehendaus einer Kammer 1 mit Deckel 2 und einer über demBoden angebrachten Überlaufvorrichtung 3,wobei die Kammer von einer Isolierung 4 und einer Außenschicht 5 umgebenist und sich in der Kammer eine in vertikaler Richtung verstellbare Hebevorrichtung 6 befindet.
    [55] Kühlboxnach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet dass die Hebevorrichtungeinen Rost 7 zum Auflegen von Gefriergut besitzt.
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    法律状态:
    2006-01-12| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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